DISTRIBUCIÓN DE LAS FRECUENCIAS ALÉLICAS Y GENOTÍPICAS DEL POLIMORFISMO GHRD3 EN PACIENTES VENEZOLANOS CON TALLA BAJA

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  Objective. The deletion (GHRd3) or insertion (GHRfl) of exon 3 is a common polymorphism in the receptor growth hormone gene (GHR) in humans. The presence of the allele GHRd3 has been associated with the degree of responsiveness to therapy with
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  Artículo recibido en : Noviembre 2008. Aceptado para publicación en : Diciembre 2008. Dirigir correspondencia a: Francisco Álvarez-Nava. falvareznava@yahoo.com DISTRIBUCIÓN DE LAS FRECUENCIAS ALÉLICAS YGENOTÍPICAS DEL POLIMORFISMO GHRD3  ENPACIENTES VENEZOLANOS CON TALLA BAJA  Francisco Álvarez-Nava 1  , Roberto Lanes 2  , Henry Marcano 3  , Tatiana Pardo 1  , William Zabala 1  , José  M. Quintero 1  , Mariela Paoli 4  , Peter Gunczler  2  , Nora Maulino 3  , Marvelys Pérez 3  , Karilé Méndez 1  , Marisol Soto 1  , Ernesto Solís 1  , Joalice Villalobos 5 1 Unidad de Genética Médica, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela. 2 Unidad deEndocrinología Pediátrica. Hospital de Clínicas Caracas. Caracas, Venezuela. 3 Servicio de Endocrinología. Hospitalde Niños “J.M. de Los Ríos”. Caracas. Venezuela. 4 Unidad de Endocrinología, Departamento de Medicina, Universidadde Los Andes, Instituto Autónomo Hospital Universitario de Los Andes. Mérida, Venezuela.  5 Servicio deEndocrinología. Hospital de Especialidades Pediátricas de Maracaibo. Maracaibo, Venezuela. RESUMENObjetivos.  La deleción ( GHRd3 ) o inserción ( GHRfl ) del exón 3 es un polimorfismo común en el gen del receptorde la hormona de crecimiento ( GHR ) en los seres humanos. La presencia del alelo GHRd3  se ha asociado con elgrado de respuesta de terapia con Hormona de Crecimiento Recombinante Humana (rhGH). El objetivo de esteestudio fue determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de este polimorfismo en un grupo de 69 niñosvenezolanos con talla baja que estaban recibiendo rhGH. Métodos.  Se extrajo DNA a través de la técnica del método combinado Fenol/Sevag e Inorgánica. Se determinóel genotipo del exón 3 del gen GHR  usando tanto PCR- monoplex como PCR-multiplex. Resultados.  Entre los pacientes con talla baja la frecuencia genotípica se distribuyó de la siguiente manera: GHRfl/GHRfl  (55%) GHRfl/GHRd3  (35%) y GHRd3/GHRd3  (10%) y la frecuencia alélica fue de 0,27 para GHRd3  y0,73 para GHRfl . Para el grupo testigo la frecuencia genotípica se distribuyo así: GHRfl/GHRfl  (56%), GHRfl/GHRd3  (30%) y GHRd3/GHRd3  (14%) y la frecuencia alélica era de 0,29 para GHRd3  y 0,71 para GHRfl . Lascaracterísticas clínicas basales de los pacientes con talla baja eran similares entre los diferentes genotiposencontrados en el grupo de estudio. Conclusiones.  La proporción del genotipo y los alelos del gen GHR  fueron similares entre el grupo testigo y lospacientes con talla baja, lo que traduce que la etiología de la talla baja no obedece a este polimorfismo. Palabras clave:  Deficiencia de Hormona de Crecimiento, Equilibrio de Hardy-Weinberg, Frecuencia Alélica yGenotípica, gen GHR  , Polimorfismo, Talla Baja. ABSTRACTObjective.  The deletion ( GHRd3 ) or insertion ( GHRfl ) of exon 3 is a common polymorphism in the receptorgrowth hormone gene ( GHR ) in humans. The presence of the allele GHRd3  has been associated with the degreeof responsiveness to therapy with recombinant human Growth Hormone (rhGH). The aim of this study wasto determine the genotypic and allele frequencies of this polymorphism in a group of 69 Venezuelan childrenwith short stature who were receiving rhGH. Methods.  Genomic DNA was extracted from blood lymphocytes using combined method Fenol/SEVAG +Salting out. The GHR-exon 3 was genotyped using both PCR monoplex and multiplex assays. Results.  Among patients with short stature, genotype frequency was distributed as follows: GHRfl/GHRfl (55%), GHRfl/GHRd3  (35%) and GHRd3/GHRd3  (10%) and allele frequency for GHRd3  and GHRfl  was 0.27 and0.73, respectively. For the control group, genotype frequency was distributed as follows: GHRfl/GHRfl  (56%), GHRfl/GHRd3  (30%) and GHRd3/GHRd3  (14%) and allele frequency for GHRd3  and GHRfl  was 0.29 and 0.71,respectively. The baseline clinical features of patients with short stature were similar among different geno-types found in the study group. Conclusions.  The proportion of genotype and allele of the GHR  gene were similar between the control groupand patients with short stature, which translates that the etiology of short stature is not due to this polymor-phism. Key words:  Allele and Genotype Frecuencies, GHR  gene, Growth Hormone Deficiency, Hardy-Weinberg Equi-librium, Polymorphism, Short Stature. Rev Venez Endocrinol Metab 2009; 7 (1): 26-34 26  27 Polimorfismo GHRD3  y talla baja INTRODUCCIÓN La Hormona de Crecimiento (GH) es elprincipal determinante del crecimientopostnatal. Es secretada por la adenohipofisis yactúa sobre las células dianas a través delreceptor transmembrana propio de la GHconocido como Receptor de la GH (GHR). Éstees el responsable de todas las acciones de la GH.La unión GH-GHR conduce a la activación dela vía Janus kinases (JAK) and Signal Transdu-cers and Activators of Transcription (STAT)(JAK-STAT) y el posterior incremento en laproducción de al menos tres péptidosdependientes de la GH: el Factor InsulinoideTipo I (IGF-I), la Proteína de Unión al IGF tipo3 (IGFBP3) y la subunidad ácido-lábil. Estos trespéptidos se combinan para formar la principalforma circulante de IGF, la cual es llevada a lascélulas dianas para unirse al receptor del IGF-I.De esta manera, la GH estimula indirectamenteuna cascada de eventos que conduce a la trans-cripción de genes blancos. Mutaciones en el gen GHR  son las responsables del síndrome deLaron, una condición autosómica recesiva detalla baja severa debido a resistencia a la GH 1-2 .También se han descrito mutaciones en el gen GHR  en pacientes con talla baja idiopática 3 .El gen GHR es un gen de copia única que selocaliza en el brazo corto del cromosoma 5, másespecíficamente en 5p13.1-p12. Este gencontiene 90 kb e incluye 9 exones codificantes(numerados de 2 al 10) y varios exones no-codificantes que se empalman alternativamenteubicados en la región 5´-no-traducida 4 . El exón2 codifica el péptido señal, los exones 3-7codifican el dominio extramembrana, el exón8 codifica el dominio transmembrana y losexones 9 y 10 codifican un dominio intracito-plasmático. Dos de las isoformas más comunesde GHR  en humanos se generan por retención( GHR-fl ) o exclusión ( GHR-d3 ) del exón 3 5 .Estos alelos tienen una amplia distribución enel humano, con un rango de frecuencia de 68-75% para el alelo GHR-fl y 25-32% para GHR-d3 6-7 . El polimorfismo proteico codificado porel alelo GHR-d3  produce la pérdida de losaminoácidos 7 al 28 y la sustitución A6D en elextremo N-terminal del dominio extracelulardel receptor, el cual se conserva evolutivamenteentre muchas especies de mamíferos. Por lotanto, el alelo codificante GHR-d3  es específicode los humanos 2 . La presencia de una sola copiadel alelo GHR-d3  parece ser suficiente para elcrecimiento normal en la especie humana. Estepatrón evolutivo sugiere que la pérdida oretención del exón 3 puede afectar la expresióndel receptor o su función, específicamente alafectar la unión con la GH, el procesamientodel receptor, su transporte, estabilidad, unióna otros ligandos, dimerización de monómerosde GHR o señal de traducción. Sin embargo,los residuos de aminoácidos desde 6 al 28 de laproteína GHR no se han podido modelar através de estudios de cristalografía, por lo quese presume que estos residuos no participandirectamente en la unión a la GH ya queestudios in vitro  han encontrado que la afinidada la GH por parte del GHR no está afectada porel polimorfismo del receptor 8 . Por el contrario,se ha especulado que esta región muy flexibledel gen GHR  puede jugar un papel fundamen-tal en los cambios conformacionales durante latransactivación de los dímeros de GHR porparte de la GH. También, es posible que juegueun efecto sobre la transcripción génica, elempalme de RNA, la estabilidad proteíca y laglicosilación así como el transporte a la mem- brana celular, etc.El GHR es un receptor transmembrana que,en humanos, contiene 638 residuos deaminoácidos (incluyendo el péptido señal demembrana de 18 residuos) y consiste de undominio extracelular de unión a hormonas de246 aminoácidos, un dominio de transmem- brana y un dominio intracito-plasmático de 350aminoácidos 2 . Una vez unido a la GH, lamolécula de GHR puede formar homodímerosque son esenciales para la activación del recep-tor, mediando, por lo tanto, los bien conocidosefectos de la GH. Después de la dimerizaciónde las dos cadenas transmembranas para formarel GHR  funcional, los individuos homocigotostienen los homodímeros GHR-fl o GHR-d3 ensu superficie, mientras los heterocigotos tienenhomodímeros de GHR-fl  , homodímeros GHR-d3 y heterodímeros de GHR-fl- GHR-d3 5 .La terapia hormonal con GH recombinantehumana (rhGH) es un tratamiento aprobadopara varias entidades entre las que se incluyenpacientes con deficiencia de GH, talla bajaidiopática, retardo del crecimiento intrauterino,y algunos trastornos genéticos como síndromede Turner, síndrome de Noonan, síndrome dePrader-Willi, síndrome de Silver-Rusell, etc. Eltratamiento se basa en dosis estándares fijascalculadas por el peso o la superficie corporaldel paciente. Existe una respuesta variable deesta terapia entre los pacientes sometidos a la  misma, la cual puede depender de variosfactores entre los cuales cabe mencionar laduración del tratamiento, la talla al comienzodel tratamiento, el retardo en la edad ósea, latalla al inicio de la pubertad, la talla media pa-rental, la velocidad del crecimiento en el primeraño del tratamiento, edad al comienzo deltratamiento, y el pico máximo de GH a laspruebas de estimulación, etc 9-12 . Sin embargoestos factores explican solo parcialmente lavariabilidad interindividual a la respuesta a larhGH, lo que implica que factores de tipogenético involucrados en la acción de la GHpueden tener un efecto en esta variabilidad,independiente de los factores ya mencionados.Ya que la GH actúa a través del GHR, esconcebible que polimorfismos en la proteínaGHR codificados por variantes alélicas en el gen GHR  , puedan afectar la respuesta a la rhGHexógena en niños deficientes o no-deficientesde GH, y esto podría abrir nuevas perspectivasen el campo de la farmacogenética. Reciente-mente, se ha reportado una asociación entre elgenotipo GHR-d3  con una mejor respuesta aaltas dosis de rhGH en niños con talla bajadebido a retardo del crecimiento intrauterinoo talla baja idiopática 8 . En ese estudio la res-puesta a rhGH se midió a través de la velocidadde crecimiento durante el primer y segundoaño de tratamiento. Los niños que tenían unoo dos alelos GHR-d3  mostraban una respuestamayor hasta el 75% en la velocidad de creci-miento en comparación con los niños quetenían el alelo GHR-fl . Estudios in vitro  usandofibroblastos HEK co-transfectados con elemen-to de respuesta lactogénico (LHRE) y los genes GHRfl  y GHRd3 y utilizando, además, la acti-vidad de la luciferasa como sistema reporterose encontró una bioactividad mayor in vitro de GHR-d3 con respecto a  GHR-fl 8 . Estos hallazgosfarmacogenéticos sobre el eje de la GH tienenel potencial de promover una base para laindividualización racional de la terapia conrhGH. Otros estudios han replicado estoshallazgos en pacientes con deficiencia severa deGH 12  , en sujetos con síndrome de Turner y conretardo de crecimiento intrau-terino 13 . Sin em- bargo, como se han reportado hallazgoscontradictorios en la respuesta a la rhGH enpacientes con talla baja y su asociación con elgenotipo GHR 14-17  , así como también a una granvariabilidad en la frecuencia alélica de los poli-morfismos GHR-fl  y GHR-d3  entre diferentespoblaciones 7  , se plantea la necesidad de estudiarla respuesta de la rhGH en la poblaciónvenezolana de pacientes deficientes y nodeficientes de GH que reciben rhGH que portenestos polimorfismos. Para tal fin, se necesitaestablecer las frecuencias genotípicas y alélicasentre individuos sanos de talla normal y enpacientes con talla baja que reciben rhGH parasentar las bases para un estudio a mayor escala MATERIALES Y MÉTODOS Individuos:   Este fue un estudio multicéntrico,analítico, retrospectivo, descriptivo, nointervencionista donde se estudiaron 69pacientes con talla baja que estaban recibiendorhGH, los cuales se identificaron previamenteen la consulta de asesoramiento genético de laUnidad de Genética Médica de la Universidaddel Zulia, Maracaibo; de la Unidad deEndocrinología Pediátrica del Hospital deClínicas Caracas, del Servicio de Endocrinologíadel Hospital de Niños “J.M. de Los Ríos”, de laUnidad de Endocrinología del HospitalUniversitario de Los Andes de la Universidadde Los Andes, Mérida y Servicio deEndocrinología, Hospital de EspecialidadesPediátricas de Maracaibo, Venezuela. Losmismos incluyeron pacientes con diagnósticode deficiencia aislada o combinada de GH,síndrome de Turner, talla baja idiopática, o conretardo del crecimiento intrauterino.Para efectos de este trabajo se tomaron encuenta las siguientes definiciones:1.Se definió talla baja como una talla pordebajo del percentil 3 para su edad y sexosegún los datos de FUNDACREDESA parala población infantil venezolana.2.Se consideró como síndrome de Turner a laausencia del segundo cromosoma sexual oalteración estructural en el mismo aunado acaracterísticas propias del trastorno(estigmas turnerianos + talla baja).3.Se consideró como retardo del crecimientointrauterino como una talla al nacer pordebajo de dos desviaciones estándares.4.Se definió como deficiencia de GH a lapresencia de niveles de GH por debajo de10 ng/ml por dos valoraciones farmaco-lógicas.5.Se definió como talla baja idiopática a lapresencia de talla baja sin una causa evidentede la misma. Éste fue un diagnóstico deexclusión después de haberse realizados losestudios señalados en los criterios deexclusión (ítem 5).28 Álvarez-N F  Polimorfismo GHRD3  y talla baja 29Los criterios de exclusión fueron:1.Edad menor de 3 años y mayor de 14 años.2.Presencia de pubertad antes o durante elprimer año de tratamiento indicado portelarquia en las niñas y un volumen testicu-lar > de 3 ml.3.Los pacientes no debieron haber recibidoterapia combinada (GH + otros fármacosinductores del crecimiento).4.Las pacientes con síndrome de Turner yaquellos con baja talla por retardo delcrecimiento intrauterino o talla bajaidiopática debieron haber tenido un valormayor de 10 ng/ml a través de dos pruebasfarmacológicas de concentraciones de GHpara descartar deficiencia de GH.5.Presencia de anormalidades en los siguientesparámetros: cariotipo (excepto para síndro-me de Turner), ecocardiograma, pruebas defuncionalismo renal, etc.Se analizaron las variables clínicas antes delinicio del tratamiento en 69 niños prepúberesde los cuales 36 pacientes tenían deficiencia deGH (21 niños y 15 niñas) y 22 eran pacientescon síndrome de Turner. El resto de lospacientes (n=11) estaban agrupados en los otrosdiagnósticos. Los pacientes con deficiencia deGH al comienzo del tratamiento tenían unaedad cronológica de 8.91 ± 4.2 años, edad óseade 5.2 ± 3.1. Veintitrés pacientes presentarondeficiencia aislada de GH y 13 deficienciacombinada. En las pacientes con síndrome deTurner la edad cronológica era de 9.1 ± 5.3 añosy la edad ósea de 6.2 ± 5.1 años.El grupo testigo estaba conformado por 50individuos venezolanos sanos con talla normalsin antecedentes familiares de talla baja selec-cionados a partir de la cohorte de estudiantesdel último bienio de la Escuela de Medicina dela Facultad de Medicina de la Universidad delZulia.  Análisis molecular:   Se tomaron 5 ml de unamuestra de sangre total por venipunción porcada individuo y se recolectaron en un tubo depropileno impregnado con EDTA disódico. Seextrajo el DNA por el método combinado Fenol/Sevag e Inorgánica (desarrollada en el labora-torio de Genética Molecular de la UGM-LUZ)y se confirmaron su integridad, verificación ycalidad.Para determinar el genotipo en el exón 3 delgen GHR  , se realizó una prueba de PCR múlti-ple, usando los primers G1: 5'-TGTGCTGGTCTGTTGGTCTG-3'; G2: 5'-GTCGTTCCTGGGACAGAGA-3' y G3 5'-CCTGGATTAACACTTTGCAGACTC-3' (número de acceso alGenBank: AF155912). Las condiciones de laPCR fueron las siguientes: una etapa inicial dedesnaturalización de 5 minutos a 94 o C, seguidade 35 ciclos que consistió 30 segundos a 94 o C,30 segundos a 60 o C, y un minuto a 72 o Cseguidos de un período de extensión final a72 o C por 7 minutos. Los productos deamplificación se visualizaron por electroforesissobre geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio. Se calcularon las frecuenciasalélicas en un grupo testigo de 50 individuosadultos sanos con talla normal para saber síestaban en equilibrio de Hardy-Weinberg y secompararon con la frecuencias alélicas en losdiferentes subgrupos de estudio.  Análisis estadístico:  Las variables cualitativas seexpresaron como frecuencias y porcentajes,mientras que las variables cuantitativas seexpresaron como promedio ± desviaciónestándar. Los pacientes se agruparon pordiagnóstico y a su vez se subclasificaron por lapresencia de los polimorfismos GHRd3  o GHRfl  para de esta manera comparar lascaracterísticas clínicas basales entre losdiferentes genotipos a través test no   pareadosde t de Student para variables continuas (edad,edad ósea, puntuación de Desviación Estándar(SDS) de la talla corregida por talla de los pa-dres, talla al comienzo del tratamiento, dondeserá considerado como significativo, un valorde  p < 0,05 .Se calculó el Equilibrio de Hardy-Weinberg   deacuerdo con el procedimiento estándarutilizando el análisis de x 2 . Se analizaron lasdiferencias de las frecuencias de genotipo GHRd3/fl  entre los grupos por la prueba x 2 . RESULTADOS Se encontró cierta inexactitud en el momentode la asignación del genotipo con la técnica dePCR múltiple competitiva descrita por Pantelet al (1995) con los genotipos homocigotos yheterocigotos d3  , siendo re-asignado despuésde una segunda PCR a  fl  (Figuras 1 y 2). Por lotanto, cuando se detectó un genotipo d3/d3 correspondiente a una banda de 532 pb y/ocuando se detectó una banda que poten-cialmente correspondía a 935 pb levementeamplificada, se hizo una nueva amplificaciónde PCR usando solamente los primeros G1 yG3 (PCR monoplex)·En la Tabla I se muestran las frecuencias  genotípicas y alélicas del grupo de estudioincluyendo todos los diagnósticos (deficienciade GH, síndrome de Turner, talla bajaidiopática, etc.). Entre los pacientes condeficiencia de GH, la distribución de losdiferentes genotipos GHR fue de 17 (54,84%)para  fl/fl ; 11 (35,48%) para  fl/d3  y 3 (9,68%)para d3/d3.  Las frecuencias alélicas de  fl  y d3 fueron de 0,73 y 0,27, respectivamente. Estosporcentajes cumplen con la Ley de Hardy-Weinberg [LH-W: a 2  + 2ab + b 2 = 0,73 2  + 2(0,73x 0,27) + 0,27 2 ) = 1]. La distribución de lasfrecuencias genotípicas en el grupo testigo fuede 28 (56%) para  fl/fl ; 15 (30%) para  fl/d3  y 7(14%) para d3/d3 . Las frecuencias alélicas de  fl y d3  fueron de 0,71 y 0,29, respectivamente.Se observó una proporción similar para losgenotipos GHRfl/GHRfl, GHRd3/GHRd3  y GHRfl/GHRd3  entre el grupo de estudio y elgrupo testigo.Los niños con los genotipos  fl/d3  y d3/d3  teníancaracterísticas clínicas basales similares ydebido a que estudios previos no han mostradodiferencias entre los pacientes heterocigotos yhomocigotos para el alelo d3  , se combinaronestos pacientes para un análisis posterior. Asímismo, no se observaron diferenciassignificativas entre las características basales(talla, sexo, deficiencia aislada o combinada,edad cronológica, edad ósea, etc.) entre aquellospacientes que tenían genotipo  fl/fl  y aquelloscon al menos un alelo d3  (  fl/d3 + d3/d3 ). DISCUSIÓN El desarrollo de tecnologías de alto impacto parala evaluación de la expresión proteica(proteómica) o de genes (genómica)involucradas en el crecimiento abre las puertaspara un mejor diagnóstico y manejo de lospacientes con trastornos del crecimiento.Nagalla y Rosenfeld han evaluado los patronesde expresión proteica en pacientes condeficiencia de GH (GHD) y con insensibilidada la GH (GHI) resultantes de mutaciones en elgen GHR  usando varias técnicas proteómicas,y han identificado patrones proteicosdiscriminatorios 25 . En estudios preliminares,pacientes con GHI o GHD pueden serdistinguidos de sujetos sanos con una certezadel 99% a través de la proteómica y los patronesproteicos de GHI y GHD pueden serdiscriminados uno de otros con una certeza del96%. Estas observaciones requieren unaconfirmación a gran escala, pero apoyanfuertemente el valor diagnóstico de estas nuevastecnologías 25 .Por otra parte, la farmacogenética es el estudiode como los genes de una persona puedeninfluir en la respuesta a un medicamento. Enla segunda mitad de siglo XX, vino a estar claroque la variación genética puede explicar porquélas personas responden de formas diferentes almismo medicamento. Desde entonces, losprogresos en la investigación de lafarmacogenética han sugerido que hay unpotencial real de trasladar estos hallazgos dellaboratorio al cuidado y manejo del paciente 26 .Existen varios ejemplos de cómo lospolimorfismos genéticos pueden influir en elresultado de la terapia 27-28 . En el presente, laconstitución de un individuo está siendoexplorada en un intento de predecir una mejorrespuesta a la terapia con rhGH. A un nivelmonogénico más simple, se sabe quemutaciones en el gen del receptor de lahormona liberadora de GH que produce unaGHD severa responderá muy bien a la rhGH,mientras que un niño con mutaciones en el gen GHR  (síndrome de insensibilidad congénita ala GH, síndrome de Laron) no lo hará. Sin em- bargo, estos genes pueden tener cambios en sussecuencias de DNA que no anulan comple-tamente la generación o función de la proteína.Estos cambios son llamados polimorfismos. Unpolimorfismo puede ser definido como unavariante en la secuencia de DNA que ocurre almenos en el 1% de la población. Estos cambiosen la secuencia del DNA de un gen no sonsuficientes para causar una enfermedad peroafectan la función de la proteína de tal maneraque da srcen a una variación natural. Unpolimorfismo individual puede tener unimpacto sobre una característica individual,pero más probablemente es el efecto sumatorioo aditivo de polimorfismos en varios genes quegenera esta variación. Se han descrito polimor-fismos en los exones 3, 6 y 10 del gen GHR 3 . Mientras que los polimorfismos en los exones6 y 10 son clásicos polimorfismos de un solonucleótido (SNPs), el primero es un inusualpolimorfismo genético consistente en ladeleción o retención de todo un exón. Estepolimorfismo tiene una amplia distribuciónentre la especie humana.Con la finalidad de comparar los pacientesestudiados con una población normal, se hananalizado el genotipo GHR  en las distintaspoblaciones (Tabla I). La proporción de los alelos30 Álvarez-N F
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