Ação do soro de cabra anti-soro de coelho imunizado ou não com células linfóides do doador sobre o alotransplante cardíaco em ratos: immunosupression of goat antiserum against rabbit serum immunized or not with donor lymphoid cells

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  Ação do soro de cabra anti-soro de coelho imunizado ou não com células linfóides do doador sobre o alotransplante cardíaco em ratos: immunosupression of goat antiserum against rabbit serum immunized or not with donor lymphoid cells
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   Acta Cirúrgica Brasileira - Vol 17 (Suplemento 3) 2002 - 69 RESUMO Introdução  - A rejeição imunológica é uma das principais causas da perda de órgãos transplantados. Atentativa do controle da reação imunológica é clinica-mente feita através da imunossupressão inespecífica eexperimentalmente também por bloqueio específico. Oalotransplante cardíaco em ratos pela técnica de ONO,K é um bom método para avaliação clínica da rejeição ede estudos voltados para o controle da rejeição. Objetivo: estudar o efeito de um anti-antisoro linfocitário, anti-linfócitos do doador sobre a rejeição do alotransplantecardíaco de ratos Wistar para ratos Holtzman. Métodos - o soro anti-linfocitário (SAL) foi obtido através daimunização de coelhos com linfócitos obtidos degânglios linfáticos da cadeia mesentérica de ratos Wistar,em solução de Tyrode, contendo 3x10 9  células/ ml. Ainoculação de 3 coelhos foi feita com 1 ml da suspensãocelular e 1 ml de adjuvante completo de Freund. Duassemanas após a primeira inoculação fez-se 4 dosessemanais de reforço. Os coelhos foram sangrados na5 a  semana, quando então foram separados os soros. Atitulação dos soros foi realizada pelo teste decitotoxicidade, sendo verificado que ambosapresentaram título de 1:1024. A dosagem de proteí-nas mostrou albumina com 3,1 e 2,7 g% e globulinascom 3,5 e 2,9 g%, sendo o normal 3,7 e 2,2 g% respec-tivamente. Os dois SAL foram misturados. Duas cabrasforam inoculados, com 3 ml da mistura desses SAL,associados a 2 ml de adjuvante de Freund. As doses dereforço com 5 ml do SAL foram iniciadas 2 semanasapós. A cabra A recebeu 8 doses (1,4 g de globulinas).A cabra B recebeu 4 doses de reforço (0,7 g deglobulinas). Uma semana após a última inoculaçãoretirou-se 125 ml de sangue de cada cabra, fazendo aseparação dos anti-soro anti-SAL (ASAL). Uma terceiracabra C foi imunizada com soro normal de coelho. Adeterminação de precipitinas foi feita pelo método deOUCHTERLONY. O ASAL A teve título de 1:64 e B eC título de 1:128. Os ASAL A e B foram capazes de bloquear “in vitro” a atividade citotóxica do SAL até adiluição de 1:2 do SAL. O soro de cabra anti-soro normalde coelho (SCANC) não foi capaz de bloquear acitotoxicidade do SAL. Os animais submetidos atransplante cardíaco foram divididos em 2 gruposcontroles um normal com 10 ratos (C1) e outro (C2)com 5 ratos que recebeu 1,0 ml endovenoso de SCANC.O grupo de ratos testes A foi composto por 19 ratos AÇÃO DO SORO DE CABRA ANTI-SORO DE COELHO IMUNIZADOOU NÃO COM CÉLULAS LINFÓIDES DO DOADOR SOBRE OALOTRANSPLANTE CARDÍACO EM RATOS 1 CARDIAC ALLOGRAFT IN RATS: IMMUNOSUPRESSION OF GOATANTISERUM AGAINST RABBIT SERUM IMMUNIZED OR NOT WITHDONOR LYMPHOID CELLS. Haylton Jorge Suaid 2 Antonio Carlos Pereira Martins 3 Silvio Tucci Jr 24 Jeova Nina Rocha 4 Antonio Antunes Rodrigues Júnior 5 Marco Antonio Gonçalves 5 Adauto José Cologna 4 1Trabalho realizado no Departamento de Cirurgia e Anatomia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP2Prof. Assoc. da Disciplina de Urologia do Departamento de Cirurgia e Anatomia – FMRP-USP3Prof. Titular da Disciplina de Urologia do Departamento de Cirurgia e Anatomia – FMRP - USP4Prof. Dr. da Disciplina de Urologia do Departamento de Cirurgia e anatomia – FMRP - USP5Médico Residente da Disciplina de Urologia do Departamento de Cirurgia e Anatomia – FMRP - USP  70 - Acta Cirúrgica Brasileira - Vol 17 (Suplemento 3) 2002 distribuídos em 3 subgrupos. Subgrupo A1 com 5 ra-tos recebeu 0,5 ml do ASAL A, via endovenosa, logoapós a cirurgia,o subgrupo A2 com 7 ratos recebeu1.0 ml do ASAL A nas mesmas condições e o subgrupoA3 também com 7 ratos recebeu 1,0 ml no dia da ci-rurgia e 1,0 ml nos outros 2 dias consecutivos. O gru- po de ratos testes B que recebeu o ASAL B foi igual aogrupo A. A avaliação dos corações transplantados foidiária através da palpação abdominal. O tempo máxi-mo de seguimento foi de 243 dias. Os corações consi-derados rejeitados foram retirados e feito estudoshistológicos. Resultados  - o período de rejeição dosgrupos foi : controles C1 e C2 foram 11,9 e 14,6 dias,respectivamente; no subgrupo A1 apenas um rato tevesobrevida cardíaca significante (153 dias), nos demaisela variou de 9 a 15 dias; no subgrupo A2 a sobrevidado coração foi significante e variou de 23 a 230 dias;no subgrupo A3 apenas 5 corações tiveram sobrevidasignificante que variou de 29 a 190 dias. A sobrevidados corações transplantados do grupo B foi significante para um animal de cada subgrupo (120,132 e 129 dias).Os corações com sobrevida longa foram retirados ba-tendo. Os demais corações foram rejeitados dentro do período de variação dos grupos controles. Conclusões - O soro de cabra anti-soro anti-linfócitos do doador,com maior período de imunização, foi capaz de blo-quear a resposta imune de rejeição dos corações trans- plantados nas doses de 1,0 e 3,0 ml. Os ratos que não promoveram a rejeição aguda dos corações transplan-tados não apresentaram anticorpos citotóxicoscirculantes. O fator causador do bloqueio parace nãoestar vinculado aos bloqueios de citotoxicidade “invitro” e do teor de precepitinas do SAL. Disponível emURL: http://www.scielo.br/acb Descritores - Transplante cardíaco, soroantilinfocitário, rejeição. ABSTRACT Objective - To study the immunosupressionefficacy an specific anti-antilymphocytic serum prepared in goats in a model of cardiac allografts inrats. Methods - Three   rabbits were immunized withlymphoid cells obtained from mesenteric lymphaticnodes of Wistar rats. Each one received subcutaneously3x10 9  cells mixed with Freund’s adjuvant. After 2weeks, they were injected with the same amount of cells at weekly intervals for 4 additional times. In the5 th  week they were bled and their serum were mixed.This serum, which had a cytotoxic titer of 1:1024, wasused to immunize 2 goats that gave rise to the anti-antilymphocytic serum (AAS-1 and AAS-2). As controlwe immunized 1 additional goat with normal rabbitserum (ANS). The gel diffusion technique (AAS xrabbit serum) showed precipitation bands against tillthe following dilution: AAS-1 – 1/64, AAS-2 – 1/128and ANS 1/124. Both AAS were able to block the invitro lymphocytotoxity of goat antilymphocytic serumtill dilution of 1:2 while ANS did not. The hearts fromWistar rats (donors) were transplanted in Holtzman rats.The transplanted rats were divide in groups: C1 – 11animals (control that received no serum); C2 – 5 animals(control that received 1ml of goat normal serum); A-19 animals – A1 with 5 rats injected intravenously inthe day of surgery with 0.5ml of AAS-1, A2 with 7rats injected with 1ml of AAS-1 only in the of surgery,and A3 with 7 rats that received 1ml of AAS-1 in days0, 1 and 2 postoperatively; and group B with 19 rats(B1, B2 and B3) treated as group A except with theAAS-2 serum.  Results - Mean heart survival in groupsC1 and C2 was respectively 11.9 and 14.6 days Survivalrange in the subgroups A1 and A2 were respectively 9to 230 days and 23 to 230 days. In subgroup A3 heartsurvival was prolonged till 29 to 190 days in 5 animals.In group B only 3 animals had prolonged (120, 130and 129 days) heart survival in comparison with thecontrol groups. Conclusion - Anti-antilymphocyticserum against donor antigen is able to suppress rejectionof cardiac allograft in rats. Key Words - Cardiac allograft, cardiac transplant,antilymphocytic serum, rejection. INTRODUÇÃO A história dos transplantes de órgãos mostra queo século passado foi de grande desenvolvimento, sendoo tema gerador de dois prêmios Nobel. O domínio dastécnicas cirúrgicas proporcionou grande divulgação dométodo, que entretanto continua encontrando a barreiraimunológica como grande adversário. As drogas e ocorticosteróide produzem um bloqueio inespecífico daresposta imune 1 . As imunoglobulinas ou frações também promovem uma imunossupressão inespecífica 2 . O bloqueio específico pode ser ativo ou passivo e podeser conseguido através da imunização dos animais comantígenos específicos do doador ou então por ação deanti-soros específicos 3 . Existem evidências que em umaresposta imune coexistam o anticorpo e o anti-anticorpo,havendo assim, uma resposta imune auto-reguladora 4 ,que promoveria o bloqueio específico da resposta imune.Diante desses fatos, foi objetivo do presente trabalhoverificar a ação de um anti-soro de cabra anti-soro decoelho contra linfócitos do doador em alotransplantecardíaco em ratos. MÉTODOS Foram realizados 53 alotransplantes cardíacos deratos Wistar (peso 200 a 300 gramas) para Holtzman   Acta Cirúrgica Brasileira - Vol 17 (Suplemento 3) 2002 - 71  pela técnica de ONO 5 . Os animais foram distribuídosem grupos e subgrupos. Os grupos controles normal ecom SCANC contaram com 10 e 5 animais,respectivamente. Os grupos experimentais A e B, quereceberam os ASAL, foram subdivididos em trêssubgrupos. O subgrupo 1 recebeu 0,5 ml de ASALlogo após o transplante, foi constituído por 5 ratos; osubgrupo 2, com 7 animais recebeu a dose de 1,0 mldo ASAL, também após a cirurgia; o subgrupo 3 querecebeu 1,0 ml no dia da cirurgia e 1,0 ml nos dois diasconsecutivos após a cirurgia contou com 7 ratos. Osratos receptores permaneceram somente comhidratação via oral na véspera da cirurgia. Todos osanimais foram anestesiados com éter. Nos ratosreceptores foi feita a tricotomia abdominal como preparocirúrgico. Em seguida foram realizados os transplantes. Preparo dos SAL : os linfócitos do doador foramobtidos de gânglios linfáticos da cadeia mesentérica.Foram suspensos em solução de Tyrode naconcentração de 3x10 9  células /ml, e inoculados nas patas de dois coelhos da raça Grande Holandez (peso2,5 e 2,8 Kg), juntamente com 1,0 ml de adjuvantecompleto de Freund, por via subcutânea. Duas sema-nas depois, iniciou-se as doses de reforço com 3x10 9 células/ml, durante 4 semanas nos gânglios regionais.Uma semana após o término do reforço, os animaisforam sangrados e obteve-se 88 ml e 90 ml de sanguede cada coelho. Os soros foram separados e estocadosa –20º C. A titulação dos SAL foi feita pelos testes decitotoxicidade. Os SAL foram diluídos a 1:2048. Ascélulas alvo (linfócitos) obtidas de gângliosmesentéricos de ratos Wistar, na concentração de 2 x10 6 /ml em solução de Tyrode enriquecida com 20% desoro de ratos Wistar foram incubadas em volumes iguaiscom 0,1 ml dos SAL e 0,05 ml de complemento decoelho. No final do período de incubação foi adicionado0,05 ml de solução de Tyrode com 1,5% de azul deTrypan. A reação foi considerada como positiva quandoo percentual de células mortas foi 30% maior que ocontrole negativo 6 . Isto se deu até a concentração de1:1024, determinando o título dos SAL. As proteínasforam dosadas pelo método do biureto (Tabela 1). De- pois disso os dois SAL foram misturados. Tabela 1  – Dosagens de proteínas dos SAL I e II e do soro de coelho normal (SCN), em ramas/100 ml. SAL ISAL IISCN Albumina3,12,73,7Globulinas3,52,92,2Proteínas totais6,65,65,9 Preparo dos anti-SAL : Duas cabras foram ino-culadas por via subcutânea com 3 ml da mistura dosSAL emulsionados com 2 ml de adjuvante completode Freund. Duas semanas depois iniciou-se as dosesde reforço com 5 ml de SAL. A cabra A recebeu 8doses e a cabra B 4 doses. Uma semana após a últimadose as cabras foram sangradas em 125 ml, os sorosseparados e estocados a – 20ºC. As precipitinas foramdeterminadas pelo método de OUCHTERLONY 7  e en-controu-se títulos de 1:64 para o soro A (ASAL A) e 1:128 para o B (ASAL B).O soro controle (SCANC) foi obtido com ainoculação de uma cabra com soro normal de coelhocom 4 doses de reforço, também apresentou título de precipitinas de 1:128.Teste de bloqueio da citotoxicidade do SAL pelosASAL A e B. e pelo anti-soro controle revelou que areação foi positiva até a diluição de 1:1024 para o con-trole e 1: 2 para os ASAL A e B.A capacidade de bloqueio da reação imune dosASAL A e B foi verificada com a sobrevida dos cora-ções transplantados.O seguimento dos animais transplantados foi fei-to diariamente através da palpação abdominal do cora-ção transplantado. Considerou-se como rejeitado quan-do houve a parada dos batimentos.O estudo histológico dos corações transplantadosfoi realizado pelo método da hematoxilina-eosina.O estudo da imunidade humoral dos ratos foireaizado pelo teste da citotoxicidade em 3 ratos de cadagrupo C1, A2 e B2. RESULTADOS A sobrevida dos corações transplantados de todosos grupos estão relacionadas na tabela 2. Os 10 cora-ções do grupo C1 foram rejeitados no período entre 7e 17 dias com média de 11,9 dias, com erro padrão de  72 - Acta Cirúrgica Brasileira - Vol 17 (Suplemento 3) 2002 0,96. No grupo C2 cujos 5 animais receberam 1,0 mldo SCANC a sobrevida dos corações variou de 10 a 17dias com média de 14,6 dias, com erro padrão de 1,39. Tabela 2  - Sobrevida, em dias, dos corações transplantados dos grupos controles C-I e C-II GruposAnimaisSobrevida individual em diasMédia  ∆∆∆∆∆ T C-I1014, 17, 8, 10, 7, 12, 12, 14, 11, 1411,910 a 14C-II 518, 13, 19, 13, 1014,611 a 18 GruposAnimaisSobrevida individual em diasCoraçõesAnimais c/rejeitadosfacilitaçãono ∆∆∆∆∆ T A-I515, 9, 9, 13, 153,41A-II726, 29, 23, 230, 212, 163,14307A-III78, 32, 12, 29, 174, 188,19025 GruposAnimaisSobrevida individual em diasCoraçõesAnimais c/rejeitadosfacilitaçãono ∆∆∆∆∆ T B-I59, 12, 10, 9, 12041B-II715, 19, 16, 11, 1161B-III614, 15, 15, 12, 13, 12951 ∆Τ  = Período de sobrevida dos corações transplantados para um intervalo de confiança de 95%. ∆Τ  = Período de tempo fixado pelo intervalo de confiança de 95%, detrminado pelos grupos controles.As sobrevidas dos corações transplantados dogrupo A são expostos na tabela 2. No subgrupo A1houve 4 corações rejeitados entre 9 e 15 dias. Um animalnão rejeitou o coração e foi sacrificado com 153 dias. No subgrupo A2 3 animais rejeitaram o coraçãoagudamente, mas acima do limite estabelecido para osgrupos controles de 18 dias. Os outros 4 animais nãorejeitaram os corações e foram sacrificados com oscorações batendo, acima de 142 dias. No subgrupo A3dois corações foram rejeitados no período determinado para os grupos controles. Dos outros 5, dois tiveramrejeição aguda com 32 e 29 dias e os demais foramsacrificados acima de 175 dias com coração batendo.As sobrevidas dos corações do grupo B estão natabela 2. No subgrupo B1, 4 animais rejeitaram oscorações dentro do período estabelecido para os gruposcontroles, entre 9 e 15 dias.um animal foi sacrificadocom 112 dias com o coração batendo. No subgrupoB2 6 ratos rejeitaram os corações e um foi sacrificadocom 132 dias, com o coração batendo. No subgrupoB3 o resultado foi igual aos outros dois subgrupos.Seis corações foram rejeitados entre o 12º e 15º dias eum foi retirado batendo com 129 dias de observação.O teste de citotoxicidade dos soros de 3 ratos dogrupo controle contra linfócitos de ratos Wistar mostrouhaver atividade antilinfócitária, enquanto que, aquelesque não apresentaram rejeição (3 do subgrupo A2 eum rato de cada subgrupo B) não apresentaramatividade contra os linfócitos do doador.O estudo anatomopatológico dos corações rejeita-dos mostrou aumento de volume, intenso processo infla-matório, degeneração de fibras musculares e trombosedas cavidades. Processo inflamatório mononuclear aoredor dos vasos com arteríolo necrose e trombose. Oscorações não rejeitados mostravam-se com tamanhonormal, com discreto espessamento das paredes. Haviaintenso infiltrado inflamatório mononuclear, com predominância de linfócitos, causando um desarranjona arquitetura das fibras musculares. Em várias áreasexistia substituição fibroblástica ou fibrose. Nasarteríolas encontrou-se hiperplasia da camada média, proliferação da íntima e trombose. DISCUSSÃO O transplante cardíaco em ratos, apesar dasdificuldades técnicas é um modelo adequado para o   Acta Cirúrgica Brasileira - Vol 17 (Suplemento 3) 2002 - 73 estudo da rejeição de órgãos vascularizados. As carac-terísticas clínicas da rejeição de aumento de volume doórgão, arritmia e parada cardíaca são detectados pela palpação abdominal. O período de aparecimento des-sas alterações é variável e dependente dahistocompatibilidade 8,9 . Os corações transplantados entreratos Wistar e Holtzman apresentam rejeição ao redor do 10º dia 10 , fato esse observados nos dois grupos con-troles C1 e C2. No grupo experimental A, 13 animaisnão rejeitaram os corações transplantados no períododeterminado pelos grupos controles, enquanto 6 foramrejeitados. Esse fato indica que o ASAL A é capaz de proteger os corações de uma forma global em 68,4%,entretanto quando se analisa os subgruposseparadamente observa-se claramente que a proteçãodepende da dose do soro administrada, com sobrevidade 20% para o grupo A1, 100% e 71,4% para ossubgrupos A2 e A3, respectivamente. Os resultadosdo grupo B não foram tão satisfatórios quanto aos dogrupo A, visto que de 19 ratos operados o bloqueioocorreu em apenas 3 animais (16,6%). É interessanteobservar que o soro A, com menor valor de precipitinasdeu maior proteção aos corações transplantados. Emrelação aos títulos do bloqueio da citotoxicidade, ambosos ASAL foram iguais. Assim, observa-se que tanto otítulo de precipitinas quanto o bloqueio da citotoxicidadenão expressam a capacidade dos ASAL em controlar areação imune. Outro fato é a diferença dos esquemasde imunização das cabras. A cabra que apresentoumenor resposta imune pelo método deOUCHTERLONY foi a que produziu o soro maisefetivo, deixando a interrogação se a imunização prolongada seria a responsável pela produção de algumasubstância bloqueadora da resposta, ou se essa respostaé dependente do animal. A variação das respostas dentrodo grupo A, além de estar correlacionada com a dosedo ASAL, também deve estar ligada ao grau dehistocompatibilidade entre os animais. Este fato deveestar relacionado ao que ocorreu com o grupo B, ondenão se observou efeito objetivo do ASAL e os animaisque apresentaram o bloqueio imune podem ter umarelação de histocompatibilidade que favoreceu, juntamente com o ASAL, o bloqueio imune. Dentro dahipótese lançada no objetivo, seria possível se inferir que a reação do ASAL com os receptores dosanticorpos provocaria o bloqueio. Entretanto isto nãoocorreu com o ASAL B, cuja ação pareceu depender de outros fatores como o grau de histocompatibilidade.Outro aspecto observado foi que o ASAL não promove um bloqueio completo da reação imune, umavez que os corações transplantados com sobrevida prolongada apresentaram uma histologia típica de re- jeição crônica. CONCLUSÕES O soro de cabra anti-soro anti-linfócitos do doador,com maior período de imunização, foi capaz de bloquear a resposta imune de rejeição dos coraçõestransplantados nas doses de 1,0 e 3,0 ml. Os ratos quenão promoveram a rejeição aguda dos coraçõestransplantados não apresentaram anticorpos citotóxicoscirculantes. O fator causador do bloqueio parace nãoestar vinculado aos bloqueios de citotoxicidade “invitro” e do teor de precepitinas do SAL. REFERÊNCIAS 1.Danton MD, McGee C, Sayegh MH. Immunossupressivestrategies in transplantation. Lancet 1999; 353: 1083.2.Szezeech ÇA, Berlin JA, Feldman HI. The effect of antiliymphocyte induction therapy on renal allograft survival:A meta-analysis of individual patient-level data. Anti-lymphocyte Antibody Induction Therapy Study Group. AmIntern Med 1998; 128: 817-21.3.McKearn TJ, Stuart FP, Fitch FW. Anti-idiotipic antibody inrat tranplantation immunity. J Immunologyy 1974; 113:1876-80.4.Rowley DA, Fitch FW, Stuart FP, Kohler H, Consenza H.Antibody directed agaisnt wither antigem or receptor for antigem cam suppress immunity specifically. Science 1973;131: 1133–6.5.Ono K, Lindsey ES. Improved technique of hearttransplantation in rats. J Thorac Cardiovasc Surg 1969;57: 225-7.6.Patel R, Terasaki PI. Significance of the positive crossmatchtest in kidney transplantation. New Engl J Méd 1969; 280:735-8.7.Ouchterlony O. Diffusion in gel methods for immunologicalanalysis. Prog Allergy 1958; 5: 1-2.8.Tilney NL. Studies on infiltrating hast cells harvested fromacutely rejecting rat cardiac allografts. 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